金思德生物:测序结果不好怪测序仪?这锅我不背,可能是文库质检方法不对

  在高通量测序实验中,为提高测序准确性、减少测序过程中的风险,要求测序前测定文库样品的浓度和片段大小分布,确定合适的上机pooling方案。常规检测包括两方面,文库的浓度检测和片段大小检测。那么问题来了,文库质检技术哪家强?下面小编带大家来看一下这两种检测常用的方法~

  浓度检测

  1NanoDrop分光光度计

  NanoDrop及其它紫外分光光度计均采用紫外吸光度进行检测。紫外吸收法原理是核酸、核苷酸及其衍生物具有共轭双键系统,能吸收紫外光,RNA和DNA的紫外吸收峰在260nm波长处,根据光吸收值计算核酸的含量。

  此法操作简便,迅速,但缺点是无法区分出DNA、RNA、降解核酸、游离核苷酸及其它杂质。综合上述的优缺点,最后不建议将该方法用于文库定量的参考,这也是为什么我们文库质检不采用此方法的原因之一。

  2Qubit荧光计

  Qubit是新一代核酸和蛋白定量仪,采用荧光染料检测特定目标分子的浓度,能够对DNA和RNA进行精准定量。 荧光染料法采用只有与DNA、RNA或蛋白质结合后才发出荧光的MolecularProbes® 染料,即该荧光染料只有与特异性的靶分子结合时,才能发出荧光信号,但游离核苷酸或降解核酸存在时也可以被检测到。

  由于Qubit®技术只检测靶分子的浓度,这种特异性可以获得十分精确的结果,可以作为后续测序定量的参考。

  3实时荧光定量PCR

  实时荧光定量PCR技术(qPCR),是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。

  Illumina文库上机测序前会先进行桥式PCR扩增反应,文库测序时的状态其实是扩增后的状态;而以P5和P7(Illumina文库两侧接头)引物做qPCR,其扩增后的产物状态和文库测序时的状态(桥式PCR扩增反应后)是最接近的。因此,以qPCR检测结果做测序上机定量是非常准确的,这也是为什么我们采用此方法来检测文库浓度的原因。

金思德生物:测序结果不好怪测序仪?这锅我不背,可能是文库质检方法不对

  文库浓度检测方法比较

  文库片段大小检测

  1琼脂糖凝胶电泳检测

  琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时受电荷效应和分子筛效应的影响,当DNA分子在高于等电点的pH溶液中时会带负电荷,在电场中向正极移动。

  琼脂糖凝胶电泳能够获得文库的片段大小范围,但不能确定文库片段大小的精确分布,灵敏度低,且无法检测含量较低的小片段和大片段,检测繁琐费时,效率低下。

  2微流控芯片技术

  安捷伦2100和Caliper芯片生物分析仪是基于微流控芯片技术的检测平台,当给芯片加入电压时,样品便在芯片上的显微蚀刻管道中进行毛细管电泳,在样品流动过程中,不同DNA片段根据其大小被分离。凝胶-染料基质中的荧光染料可嵌入DNA双链,通过激光激发荧光,使其被仪器检测到,仪器依据收集到的荧光信号强度对样​品定量。

  微流控芯片技术通过芯片电泳的方式提高平板电泳质量,对文库每一个片段的大小进行精确测定,可对文库进行定性和定量,判断文库构建是否成功。文库测定时可根据需求,选择不同灵敏度芯片。

  金思德生物:测序结果不好怪测序仪?这锅我不背,可能是文库质检方法不对

安捷伦2100芯片检测范围

金思德生物:测序结果不好怪测序仪?这锅我不背,可能是文库质检方法不对

  文库片段大小检测方法比较

  上面讲了这么多,大家有没有对文库质检的方法有清晰的了解呢?我们会提供专业的文库质检,真实反映文库的状态,确保文库以最佳的方案测序,下面是文库的送样标准,请大家仔细阅读哦~

金思德生物:测序结果不好怪测序仪?这锅我不背,可能是文库质检方法不对

  HiSeq X 上机文库标准

金思德生物:测序结果不好怪测序仪?这锅我不背,可能是文库质检方法不对

  非HiSeq X 上机文库标准

  测序结果不好的锅测序仪不背,其实影响测序结果的因素有很多,包括文库的质量,文库的上机定量,测序仪的状态等,所以文库质检一定不能马虎哦~小编已经把关于文库质检的压箱底知识都分享出来了,希望对大家的测序实验有所帮助,

金思德生物:测序结果不好怪测序仪?这锅我不背,可能是文库质检方法不对
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