金思德生物:何为荧光定量PCR及检测原理和实验室应用

  1荧光定量PCR荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR,RT-PCR),又名定量PCR, 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新兴定量分子检测技术,通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,结合了核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应软件对扩增产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。

  2检测原理

  2.1 PCR技术

  聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点,是能将微量的DNA大幅增加。

  PCR技术是根据温度的变化使DNA在体外变性成单链,引物与单链按碱基互补配对的原则结合,并利用DNA聚合酶使游离dNTP(脱氧核糖核苷酸)沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。典型的PCR由①高温变性模板;②引物与模板退火;③引物沿模板延伸三步反应组成一个循环,通过多次循环反应使目的DNA得以迅速扩增。

 

2.2 实时荧光定量PCR技术

  实时荧光定量PCR技术,是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料,通过检测PCR反应过程中荧光信号的变化来实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析,也可通过Ct值和扩增曲线对样本进行定性判断。常见的荧光标记方法包括2种:荧光探针法和荧光染料法,且以前者居多。

  (1)荧光标记探针法(TaqMan探针法)

  TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术,其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性,切断探针,产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合,所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中,包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合,其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R),如FAM、VIC等,3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q),如TAMRA等。当探针完整的时候,报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收,仪器检测不到信号。随着PCR的进行,Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针,其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断,报告基团远离淬灭基团,其能量不能被吸收,即产生荧光信号。所以,每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步指数增长的过程,荧光信号的强度代表了模板DNA拷贝数。(如图1)

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图1 荧光探针法原理图

  (2)荧光染料法(SYBR Green I法)

  SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当其与DNA双链结合时,发出荧光;从DNA双链上释放出来时,荧光信号急剧减弱。因此,在一个体系内,其信号强度代表了双链DNA分子的数量。基本作用机制为:开始反应,SYBR Green染料与DNA双链结合发出荧光;DNA变性解链,染料释放出来,荧光急剧减少;在聚合延伸过程中,引物退火并形成PCR产物;聚合完成后,染料再次与双链产物结合,仪器系统检测到荧光量加大。(如图2)

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图2 荧光染料法原理图

  2.3 荧光定量PCR重要概念

  一般而言,荧光扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,无法判断产物量的变化;在平台期,扩增产物已不再呈指数级增加,PCR终产物量与起始模板量之间没有线性关系,无法计算起始模板拷贝数。因此只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,故选择在这个阶段进行定量分析。为了定量方便,在实时荧光定量 PCR 技术中引入了几个重要的概念:扩增曲线、荧光阈值、CT值

  (1)扩增曲线

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注:

  横坐标:代表扩增循环数;

  纵坐标:代表荧光强度,每个循环进行一次荧光信号收集。

  (2)荧光阈值(Threshold)

  在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,但一般荧光阈值的设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。(如下图)

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(3)CT值

  每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。同时,对于荧光PCR实验来说,CT值也是判读样品阴阳性的重要指标。(如下图)

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  3实验室应用

         PCR检测方法在临床医学及实验室检验中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。理论上,只要样本有一个病原体存在,PCR方法就可以检测到。该方法对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题,常用于疾病的早期诊断,可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。

  大量的荧光定量PCR研究资料表明,病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性及治疗效果均有相关性。因此,通过荧光定量PCR方法得到的检测结果,一定程度上可以准确反映疾病感染的情况。

  除此之外,也可以见于肿瘤分子机制、遗传病筛查、样本成分鉴定等多方面的实际应用中。

  天津金思德生物技术有限公司是以研发、生产为主体的高新技术器企业。致力于生命科学最热门的基因工程领域,自主品牌PCR基因扩增仪系列、测序仪系类及相关分子生物试剂的研发、生产和经营。

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