金思德生物:常规PCR技术的发展(Current PCR,C-PCR)

  1. 简并引物PCR技术(PCR with Degenerate Primers)

  已知马铃薯Y病毒组(PVY)病毒种间的RNA序列同源性(Homology)约64% ,一病毒株系间的同源性达94%以上。但随着对PVY组病毒RNA功能结构研究的不断深入,植物病毒专家们发现这一同源特性主要存在于PVY组病毒RNA的外壳蛋白基因(CP)和RNA复制酶基因(Nla)功能区。于是Langeveld和Bol等〔 1〕根据其保守序列(Conserved Sequence)设计了4对几乎能适合于整个PVY组病毒的简并引物(Degeneration Primers)对鳞球茎观赏花卉PVY组病毒进行鉴定和分子生物学结构特性研究。

  同年Robertson等报道了根据黄化病毒组(Luteovirus)3个病毒成员CP基因和17K蛋白基因的保守序列设计了一组适合于Luteovirus组的简并引物。本简并引物不仅适用于对马铃薯卷叶病毒(PLRV)、大麦黄矮病毒(BYDV)和甜菜西部黄化病毒(BWYV)进行检测和鉴定,而且也适用于对BYDV的5个血清型MAV、PAV、RMV、RPV和SGV进行鉴定和比较。这样就给对Lu-teovirus病毒组的研究提供了一种既快速、灵敏、又经济、方便的技术方法和路线。

  2. 病毒组专化性引物PCR技术(PCR with Group Specific Primers)

  PCR技术在双生病毒(Geminivirus)组的进化研究中得到了广泛应用。 Howarch根据16种双生病毒与复制功能相关的蛋白基因和15种CP基因的同源性,在同源区域设计了适合于整个双生病毒组的普通引物,从而构成了Geminivirus组病毒的种类进化发生树(Phylogeny Tree)。

  3. 类菌原体、类细菌体类的PCR检测技术

  自从Cousin等〔 3〕首次发表利用DNA扩增技术快速鉴定Mycobacterial bovis以来,PCR技术也陆续应用于植物病原类菌原体(MLOs),类细菌体(Mycobacterial)的检测和鉴定中。

  PCR扩增所需引物有两个来源,一类是来自MLOs 16S rDNA的保守序列 ,另一类是来自尚无定序的MLO DNA克隆片段。显然采用后者引物是既麻烦又费时,尤其是对那些至今尚无法分离培养的MLOs更是无法进行。因此目前广泛采用的是前一种来源的引物。根据保守序列设计的一套引物可以广泛检测大多数MLOs。如果选用专化性相对较窄的引物,则可以专化性地检测一种或几种MLOs。

  虽然人们在探索更方便、更简单、更经济、更广泛的PCR应用检测技术的过程中形成和发展了常规PCR技术,但同时它们都不可缺少地要和其他分子生物学方法,如PCR扩增产物限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)、基因序列分析等相结合,才能完成一种或几种病毒的检测、鉴定或研究。

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