金思德生物:改良PCR技术的发展

  1.免疫捕捉PCR技术(Immuno-Capture PCR, IC-PCR)

  在进行RT-PCR扩增反应前,利用病毒专化性抗体与病毒抗原相结合的原理,将目标病毒固定在微管或微板等固相上,经洗涤、洗脱处理后富集病毒,再进行RT-PCR反应。这样不仅避免了常规RT-PCR RNA样品制备的损失和破坏,而且捕捉RNA的效率达96%以上,提高了RNA浓度,也相应提高了RT-PCR的灵敏度。

  Wetzel首次利用IC-PCR技术对李痘病毒(PPV)进行检测研究,认为其灵敏度比常规PCR提高了250倍。而后Derks、Brandt、Jally、Saillard等分别应用IC-PCR技术对百合斑驳病毒(LiMoV)、百合烟草脆裂病毒(TRV)、葡萄扇叶病毒(CFLV)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)及其传播介体蚜虫(Myzus persicae)和柑桔立克次体(Spiroplasma-citri)进行了检测,效果十分理想。

  Steinkellner把菜豆黄色花叶病毒(BYMV)的普通引物引用到BYMV的IC-PCR扩增技术,证实了PVY组病毒基因间同源性关系。

  Candresse利用IC-PCR技术不仅成功地鉴定出PPV和苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV),而且还对其分子结构的变异性进行了全面分析。尤其是Derks在ELISA和常规PCR技术检测结果为阴性的情况下,利用IC-PCR技术则检测到了储存期百合鳞球茎内的极微量TRV。

  2.免疫PCR技术(Immuno-PCR,I-PCR)

  应用C-PCR技术检测或研究病毒时,必须知道目标RNA的核苷酸序列或部分序列,而I-PCR技术可以在未知RNA核苷酸序列时也能进行PCR检测。利用A蛋白可以与IgG Fe片段相结合,以及A蛋白-抗生蛋白链素(亲合素)嵌合体具有对生物素(Biotin)和IgG Fe片段双向专化性亲合的特点,把一种特定的生物素化的DNA分子(DNA Tag)作为一个标记物,使之与嵌合体相结合,再利用特定DNA分子的特异性引物,对DNA分子进行PCR扩增,从而使抗原得以检测。

  Sano等〔 6〕首次报道了称之为抗原检测系统(An Antigen System)的免疫PCR技术。把小牛血清白蛋白(BSA)作为抗原研究对象,利用BSA抗血清(抗体)和A蛋白——抗生蛋白链菌素嵌合物(Streptavidin-protein A Chimera)和生物素化线性UC19质粒结合物(Biotinylated Linear Plas-mid DNA PUC19 Conjugate)及特异的PUC19 DNA引物相结合原理,成功地完成了BSA检测,并认为I-PCR的灵敏度比免疫放大ELISA提高了107倍。

  理论上讲I-PCR可以检测单个抗原分子,而Sano实际检测的BSA是580个分子。如果控制DNA残体片段的浓度和各种影响因子,I-PCR的灵敏度会进一步得以提高。

  3.生物素化引物的模板捕捉PCR技术(Template Capture-PCR with Biotinylated Primers)

  这是一种简单、方便、能提供高纯度扩增用RNA底物的PCR技术,它减少RNA样品制备的复杂环节,提高了RT-PCR的灵敏度和专化性。

  生物素化的病毒专化性引物(Biotinylated Primers)和植物总RNA样品进行杂交,在杂交物进行退火时,用抗生蛋白链菌素(亲合素)包被的磁珠(Streptavidin Dynal Beads)进行捕捉,经洗涤、洗脱后,将纯化的RNA-生物素化引物进行PCR扩增。

  4.扩增转录技术(Transcription Based Amplification)

  扩增转录技术包括转录扩增技术系统(The Transcription Amplification System,TAS)和半保留式复制(Semi-sustained Sequence Replication, 3SR)两种方法。在常规PCR技术对某些材料或同一材料不同部位的病毒的检测达不到最低灵敏度要求时,利用TAS和3SR系统可以检测极其微量的病毒。一般来说TAS-PCR和3SR-PCR的灵敏度比单纯的PCR提高102倍以上。

  TAS是根据RNA模板在逆转录酶(RTase), RNase H和依赖DNA的RNA聚合酶(DNA-dependant RNApolymerase)等外源酶作用下体外等温对数增长的原理,完成PCR扩增反应。即在合成sscDNA时加入连接有T7 RNA启动子的标准引物,在进行PCR反应时加入T7 RNA聚合酶(T7 RNA Polymerase),使dsRNA的含量得以提高的同时转录成sscDNA的量也得以扩增,提高了PCR扩增水平。Guatelli〔 8〕首先报道了这一方法,继而Lizard等进行了更深入研究,Rosner也把这技术引入了植物病毒BYMV的检测。

  3SR是因为专化性引物含有能被噬菌体T7 RNA聚合酶识别的启动因子,从而完成RNA的转录、扩增。

  5.PCR-ELISA定量分析技术

  PCR扩增产物往往需要定量分析,不仅可以满足不同PCR方法和ELISA方法的灵敏度比较及揭示不同样品制备方法的差异性比较等的常见需要〔 9〕 ,而且还可以应用于特异性目标序列的检测和扩增产物的点突变或缺失的检测。

  PCR扩增产物量的比较通常采用的是Agarose凝胶电泳结合Southern杂交或点杂交等方法,这样不仅过程繁琐,样品需求量较大,需要时间长,而且更为重要的还是无法定量。

  PCR-ELISA检测有两个主要步骤:首先是DIG11-dUTP渗入到扩增DNA中,经变性后与生物素标记的捕捉探针杂交,然后加到抗生蛋白链菌素包被的微孔板上。类似ELISA洗涤步骤除去非特异性扩增物,用抗DIG-POD的酶标结合物与底物POD进行显色反应。反应结果可直接用肉眼进行相对比较,也可用酶标仪进行定量。检测效果达到膜杂交水平,整个检测过程可在1~ 3 h内完成。

金思德生物:改良PCR技术的发展
网址:http://www.genesd.net.cn/hynews/127.html

天津金思德生物技术有限公司

客服热线:022-84970393
李小姐 18920118658 18920795057

    Copyright 金思德生物 版权所有
    津ICP备17004513号-1
        金思德仪器维修网站                

在线客服系统