金思德生物:实时荧光定量PCR技术(FQ-PCR)的定量原理

  实时荧光定量PC R技术于1996年由美国Applied Biosys-terns公司推出。与常规PCR相比,它具有特异性更强、能有效解决PCR产物污染、自动化程度高、能对起始模板进行准确定量等特点。

  实时荧光定量PCR的反应原理:

  (1) CT值:表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明,各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT,值越小,反之亦然。利用己知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表CT值。因此,只要获得未知样品的CT值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

  (2) 荧光域值(threshold)的设置:PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光木底信号,荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准的10倍,即threshold = 10 x Sdcycle6-15。荧光域值设定在PCR扩增的指数期。

  (3)基线(Baseline ):是指在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近-条直线,这样的直线即基线。

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