金思德生物:如何提高PCR成功率

  如何提高PCR成功率

  1. 模板:高质量(纯度)DNA模板可以提高PCR反应成功的几率,并且要避免之前相关PCR反应的污染。

  2. 引物引物的长度一般为20-30 bp,GC含量应为40-60%,并且平均的分布在引物中。两引物的退火温度相差应在5°C以内。引物内不能存在二级结构,两引物之间不能互补,以防出现引物二聚体而减少产量。

  3. Mg2+浓度:多数使用Taq DNA聚合酶的PCR反应,最适Mg2+浓度为1.5-2.0 mM。可以用0.5或1.0 mM递增浓度来确定最适 Mg2+浓度。

  4. dNTPs:每种dNTPs的浓度一般都为200 µM,多重PCR,可以适当提高dNTP的用量,但不超过400µM。

  5. DNA聚合酶:PCR反应体系中DNA聚合酶并非越多越好,过量的聚合酶会导致PCR失败。对于Taq DNA polymerase在进行特异性扩增时,可用5-50 U/ml的用量。

  6.降低非特异扩增:反应开始以及在第一轮热循环时,非特异性链的合成,可以通过以下步骤来避免:所有的反应成分都应置于冰上,且添加反应成分亦需在冰上操作,最后加入聚合酶,并立即将反应体系置于已预热至 变性温度 (94°C) 的扩增仪中。 或使用热启动的聚合酶来避免非特异性产物的扩增。

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