金思德生物:蓝白斑筛选原理

金思德生物:蓝白斑筛选原理

  野生大肠杆菌具有完整的乳糖操纵子系统。蓝白斑筛选利用的是乳糖操纵子系统。乳糖分解代谢相关的三个基因,lacZ、Y、A就是很典型的是上述基因簇。LacZ编码β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)。菌落一般是白色的,那蓝色是怎么出来的呢?这是由于β-半乳糖苷酶分解X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生一种叫做5-溴-4-氯靛兰的蓝色产物。乳酸存在的前提下,大肠杆菌本身是能够表达β-半乳糖苷酶的,能够用来进行蓝白斑筛选的菌株是β-半乳糖苷酶缺陷型菌株,像一般的大肠杆菌感受态JM109 DH5α TOP10等都是。

  β-半乳糖苷酶可以拆分成两个部分,N端和C端。β-半乳糖苷酶缺陷型菌株的基因组中含有表达β-半乳糖苷酶C端的基因,而N端(一个146个氨基酸的短肽,即α肽链)的基因被安放到了表达的载体中。N端基因经过改造,中间插入多克隆位点。这段经过改造的N端基因被称为lacZ基因。

  质粒lacZ基因编码的α肽链(酶的N端)和菌株基因组表达的β-半乳糖苷酶的C端互补,具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用,具有分解X-gal生成蓝色物质的能力。这种现象也叫α-互补。操作中,添加IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)以激活lacZ中的β-半乳糖苷酶的启动子,在含有X-gal的固体平板培养基中菌落就会呈现蓝色。但是当MCS位点上插入DNA片段时,lacZ基因就失活了,β-半乳糖苷酶C端都不认识,没法完成α互补,β-半乳糖苷酶失活,无法分解X-gal,因此菌落就是白色的。

金思德生物:蓝白斑筛选原理
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