高纯度质粒小提试剂盒(磁珠法)

高纯度质粒小提试剂盒(磁珠法)

  【产品名称】质粒 DNA 提取试剂盒(磁珠法)

  【产品编号】A2

  【储存条件 】 试剂盒置于常温(15 - 25℃)保存,磁珠于 2 - 8℃保存

  【使用范围】适用于各种质粒 DNA 的提取,适用于手动、半自动、全自动化

  核酸提取平台

  【作用原理】在一定的缓冲液体系中磁珠吸附质粒 DNA,借助外加磁场作用

  与溶液中蛋白等杂质分离,经过洗涤除杂,在一定的洗脱缓冲液体系中将质粒

  DNA 重新释放到溶液中,达到快速分离纯化质粒 DNA 的目的。

  【试剂盒组成】

试剂盒组成 数量(50T) 数量(100T)
溶液A 10ml 20ml
溶液B 12.5ml 25ml
溶液C 10ml 20ml
磁珠溶液 1.25ml 2.5ml
结合液 27.5ml 55ml
洗涤液 10ml 20ml
洗脱液 15ml 30ml
RNaseA(10mg/ml) 100µl   200µl 

  【注意事项】

  1. 溶液 A 在初次使用之前先加入 Rnase A(将试剂盒中提供的 RNase A 全部加入),混匀,置于 2-8℃保存。

  2.使用前应先检查溶液 B 和溶液 C 是否浑浊,如有浑浊现象,可在 37℃烘箱或水浴加热几分钟,混匀至白色沉淀完全溶解。

  3.实验开始前需将洗脱液预热到 56℃。

  4. 如果加入溶液 B 后溶液澄清度差,可以适当增加溶液 B 用量或减少菌体用量以保证溶液澄清,充分裂解菌体。

  5.如果要提取低拷贝质粒或大于 10kb 的质粒,应加大菌液使用量,使用 5-10ml 过夜培养菌液,同时按照比例增加溶液 A、溶液 B 和溶液 C 的用量,结合和洗脱时可以适当的延长时间,以增加提取效率。其他步骤相同。

  【操作步骤】】

  使用前请在洗涤液 中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶上的标签。

  1.  取 1~5 ml 菌液至 EP 管中,12000 rpm 离心 1min,弃去上清液(菌液较多时可以通过数次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。

  2.  向留有菌体沉淀的离心管中加入 150 µl 溶液 A( 请先检查是否加入 RNase A),使用移液器或涡旋震荡器彻底悬浮菌体沉淀。

  注意: 如果未彻底混匀 菌块 , 会影响裂解并导致质粒提取量和纯度偏低。

  3.  向离心管中加入 200 µl 溶液 B,温和的上下颠倒 6~8 次使菌体充分裂解。

  组注意:一定要温和的混匀,以免细菌基因组 DNA  污染,此时菌液应变得清亮粘稠,作过 用时间不应超过 5min ,以免质粒受到破坏。

  4.  向离心管中加入 150 µl 溶液 C,立即温和上下颠倒 6~8 次,充分混匀,此时溶液会出现白色絮状沉淀,12000 rpm 离心 10min。

  注意:液 溶液 C  加入后应立即混合, 避免产生局部沉淀 。如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。

  5.  用移液器将上一步所得上清液转移到 1.5 ml~2.0 离心管中。再加入 450µl 结合液、20 µl磁珠) (用前震荡混匀磁珠溶液),抽打混匀或震荡混匀,使磁珠均一悬浮在溶液中,室温(15-25℃)放置 5 min(放置过程中混匀 2-3 次),将离心管置于磁力架上静置 30 s,吸弃上清( 吸净管盖及管底残液)。

  6.  向离心管中加入 350 µl 无水乙醇,用移液器抽打磁珠溶液 5~10 次或涡旋震荡混匀 10s,然后将离心管置于磁力架上静置 30 s,吸弃上清(吸 吸 净管盖及管底残液)。

  7.  向离心管中加入 350 µl 洗涤液( 请先检查是否加入无水乙醇),用移液器抽打磁珠溶液5~10 次或涡旋震荡混匀 10s,然后将离心管置于磁力架上静置 30 s,吸弃上清( 吸净管盖及管底残液)。

  8.  重复步骤 7,将开盖的离心管置于磁力架上,室温干燥 5~10 min( 吸弃上清后可放置1-2min ,再除去残留液体)。 目的是将管中残留的洗涤液去除,否则洗涤液中的乙醇会影响后续的实验:如酶切、PCR 。等实验。 但也不要干燥太长时间,以免难以洗脱核酸。

  9.  将离心管中从磁力架上取下,向离心管中加入 50~200 µl 经 56℃水浴预热的洗脱液,用移液器抽打或涡旋震荡混匀磁珠溶液,56℃水浴 5 min( 期间 轻点液 混匀磁珠溶液 2-3次 )。然后将离心管置于磁力架上静置 30 s,吸取上清液至干净的离心管中,标记保存。

  注意:在操作中如发现管壁或管盖上有液体可以短时离心将其甩至管底。的 洗脱液的 PH用值对洗脱效率有很大影响,若用 ddH2O 做洗脱液,应保证其 PH 值在 7.0-8.5  范围内,PH 值低于7.0 会降低洗脱效率。且DNA 产物应保存在-20 ℃,以防 DNA  降解。

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